质粒DNA的提取、酶切与PCR鉴定-20xx医学-第二实验室(14200字)

发表于:2017.4.16来自:www.ttfanwen.com字数:14200 手机看范文

生物化学实验报告

姓 名:

学 号:

专业年级: 2012口腔医学

组 别: 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

一、 实验室规则

1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告

2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。

3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。

4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。

5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。

6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。

7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。

8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。

9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。

10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归臵好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。

二、实验报告的基本要求

实验报告通过分析总结实验的结果和问题,加深对有关理论和技术的理解与掌握,提高分析、综合、概括问题的能力,同时也是学习撰写研究论文的过程。

1.实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。

2.实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程与操作步骤)要求在实验课前预习后撰写,作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。

3.每项内容的基本要求

(1)实验原理:简明扼要地写出实验的原理,涉及化学反应时用化学反应方程式表示。

(2)实验材料:应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪器。说明化学试剂时要避免使用未被普遍接受的商品名和俗名。试剂要标清所用的浓度。

(3)实验步骤:描述要简洁,不能照抄实验讲义,可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示,但对实验条件和操作的关键环节应写清楚,以便他人重复。

(4)实验记录:包括主要实验条件、实验中观察到的现象及实验中的原始数据。

(5)结果(定量实验包括计算):应把所得的实验结果(如观察现象)和数据进行整理、归纳、分析、对比,尽量用图表的形式概括实验的结果,如实验组与对照组实验结果的比较表等(有时对实验结果还可附以必要的说明)。

(6)讨论:不应是实验结果的重述,而是以结果为基础的逻辑推论。如对定性实验,在分析实验结果的基础上应有中肯的结论。还可以包括关于实验方法、操作技术和有关实验的一些问题,对实验异常结果的分析和评论,对于实验设计的认识、体会和建议,对实验课的改进意见等。

(7)结论:一般实验要有结论,结论要简单扼要,说明本次实验所获得的结果。

三、实验报告的评分标准(百分制)

1.实验预习报告内容(30分)

学生进入实验室前应预习实验,并书写预习报告。实验预习报告应包括以下三部分: ①实验原理(10分):要求以自己的语言归纳要点;②实验材料(5分):包括样品、试剂及仪器。只列出主要仪器、试剂(常规材料不列);③实验方法(15分):包括流程或路线、操作步骤,要以流程图、表格式给出要点,简明扼要。依据各部分内容是否完整、清楚、简明等,分以下三个等级给分。

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优秀:项目完整,能反映实验者的加工、整理、提炼。

合格:较完整,有一定整理,但不够精炼。

不合格:不完整、缺项,大段文字,完全照抄教材,记流水账。

实验预习报告不合格者,不允许进行实验。该实验应重新预约,待实验室安排时间后方可进行实验。

2.实验记录内容(20分)

实验记录是实验教学、科学研究的重要环节之一,必须培养严谨的科学作风。

实验记录的主要内容包括以下三方面:①主要实验条件(如材料的来源、质量;试剂的规格、用量、浓度;实验时间、操作要点中的技巧、失误等,以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据);②实验中观察到的现象(如加入试剂后溶液颜色的变化);③原始实验数据:设计实验数据表格(注意三线表格式),准确记录实验中测得的原始数据。记录测量值时,要根据仪器的精确度准确记录有效数字(如吸光值为0.050,不应写成0.05),注意有效数字的位数。

实验记录应在实验过程中书写;应该用钢笔或者圆珠笔记录,不能用铅笔。记录不可擦抹和涂改,写错时可以准确划去重记。记录数据时请教师审核并签名。

实验记录分以下三个等级给分。

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优秀:如实详细地记录了实验条件、实验中观察到的现象、结果及实验中的原始数据(如三次测定的吸光度值)等;实验记录用钢笔或者圆珠笔记录,没有抹擦和涂改迹象。书写准确,表格规范(三线表)。有教师的签字审核。

合格:记录了主要实验条件,但不详细、凌乱;实验中观察到的现象不细致;原始数据无涂改迹象,但不规范。有教师的签字审核。

不合格:记录不完整,有遗漏;原始数据有抹擦和涂改迹象、捏造数据(以0分计);图、表格形式错误;用铅笔记录原始数据;无教师的签字审核。 若记录的结果有怀疑、遗漏、丢失,必须重做实验,培养严谨的科学作风。

3.结果与讨论(45分)

(1)数据处理(5分)

对实验中所测得的一系列数值,要选择合适的处理方法进行整理和分析。数据处理时,要根据计算公式正确书写中间计算过程或推导过程及结果,得出最终实验结果。要注意有效数字的位数、单位(国际单位制)。经过统计处理的数据要以X〒SD表示。可分成以下三个等级给分。

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优秀:处理方法合理,中间过程清楚,数据格式单位规范。

合格:处理方法较合理,有中间计算过程;数据格式单位较规范。

不合格:处理方法不当;无中间过程;有效数字的位数、单位不规范。

(2)结果(20分)

实验结果部分应把所观察到的现象和处理的最终数据进行归纳、分析、比对,以列表法或作图法来表示。同时对结果还可附以必要的说明。

要注意图表的规范:表格要有编号、标题;表格中数据要有单位(通常列在每一列顶端的第一行或每一行左端的第一列)。图也要有编号、标题,标注在图的下方;直角坐标图的纵轴和横轴要标出方向、名称、单位和长度单位;电泳图谱和层析图谱等要标明正、负极方向及分离出的区带、色带或色斑的组分或成分。电泳结果还要标记泳道,并在图题下给出泳道的注释;要标出分子量标准的各条带的大小。并且注意需要结合图表对结果进行较详细的解释说明。

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可分成以下三个等级给分。

优秀:实验结果有归纳、 解释说明,结果准确,格式规范。

合格:堆砌实验现象、数据,解释说明少。

不合格:最终实验结果错误且无解释说明,图表、数字不规范。

(3)讨论(20分)

讨论应围绕实验结果进行,不是实验结果的重述,而是以实验结果为基础的逻辑推论,基本内容包括:①用已有的专业知识理论对实验结果进行讨论,从理论上对实验结果的各种资料、数据、现象等进行综合分析、解释,说明实验结果,重点阐述实验中出现的一般规律与特殊性规律之间的

关系;②实验结果提示了哪些新问题,指出结果与结论的理论意义及其大小;③对实践的指导与应用价值;④实验中遇到的问题、差错和教训,与预想不一致的原因,有何待解决的方法,提出在今后的实验中需要注意和改进的地方;⑤实验目的是否达到。

同时能结合查阅的其他文献等资料进行讨论,有独到的见解。在实验结果和理论分析的基础上,经过推理,归纳规律得出结论。结论要严谨、精炼,表达要准确,与实验目的呼应。也分三个等级给分。

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优秀:分析实验结果的问题与经验;分析实验设计的优劣;能提出实验技术、方法的改进意见;能结合自己查阅的其他资料来讨论,有自己独到的见解;有结论。

合格:仅针对实验结果进行讨论,有一定自己的见解。

不合格:将讨论写成注意事项分析或回答思考题等,与实验结果无关。

4.格式与版面(5分)

按照实验报告的书写格式、版面是否整洁、工整,分三个等级给分。

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优秀:实验报告字体工整,版面整洁。

合格:实验报告字体较工整,版面较整洁。

不合格:实验报告字体潦草,版面凌乱。 5. 加分(5~10分):

以全英文书写实验报告视情况加5~10分。

Introduction to Biochemistry Experiment

Biochemistry experiment is a preclinical curriculum of omni-specialties in biomedicine and an experimental curriculum for going with biochemistry teaching. Its task is to help students to understand and master the basic technical principles and methods in biochemistry, to possess the abilities of analyzing problems and working out solutions independently. By learning this curriculum, the students should understand the basic experimental principles of spectrophotometry,chromatography, electrophoresis and centrifuge, et al.,master the basic technical skills commonly used with these principles and possess the abilities to apply the skills systematically and to optimize the experiment conditions. The goal of biochemistry experiment is to make the students strengthen their grasp of the biochemistry theories and to integrate what they have learned with scientific research and clinical application.

There are 9 experiments that represent most important areas of biochemistry including characterization of proteins and nucleic acid by electrophoresis and spectroscopic or chromatographic analysis. These experiments are essential for a typical one-semester course and are to be revised and updated when necessary. New experiments will be added to this list in the future to cover more topics of biochemistry and to reflect the many advances in biochemistry.

Biochemistry Laboratory Rules

1.Pre-Laboratory Preparation

All students must prepare BEFORE ARRIVING IN THE LABORATORY. The experiments are designed so that they can be carried out – with proper advance planning – within the four-hour laboratory periods. It is expected that students should have a fundamental understanding of the theory and practices pertaining to the experiment before entering the laboratory to conduct these experiments.

Biochemical experiments often employ toxic chemicals. For the health and safety of all students, the experimental protocols must be studied and the day’s activities should be planned in advance. If it becomes obvious that a student is ill-prepared, he or she will not be permitted to continue the experiment.

2.Safety Precautions in the Biochemistry Laboratory

All INJURIES, no matter how minor, should be reported to the instructor IMMEDIATELY. If you have any questions regarding the safe handling of any biochemical, consult your instructor.

3.Strictly follow the experimental procedures.

Turn to instructors immediately for help once the laboratory instruments don’t work. DON’T try to fix the breakdown by yourself. Proper compensation for loss because of your own fault will be demanded.

4.Disposal of Solutions

In most cases the solutions used during the laboratory can be disposed of as directed by laboratory personnel at the end of the period. Any volatile organic solvents should be placed in the hood as directed. Laboratory personnel will then dispose of these solvents.

5.Solid trashes including waste papers are prohibited to discard into the sink.

6.All the glassware should be cleaned immediately after use. And all the reagent bottles and instruments should be placed neatly after use.

7.An experiment report should be submitted to the Professor and/or TAs in time. Laboratory Report

1.Although students will work in pairs for all experiments, each student must turn in an individual laboratory report, written by himself or herself. These reports should be clearly written in ink, typed, or printed and be clear and legible. If mistakes are made, neatly cross them out and enter the corrections nearby. Reports should be written in the third person (e.g., do not use “I” or “we”). STAPLE a Title Page to the top of the report and STAPLE the accompanying graphs, tables, and laboratory notebook sheets to the back. If the report is not clearly presented, the instructor may return the report without grading it.

2.Each laboratory report should consist of:

a. Title Page

A title page for each experiment is required and should state the title of the experiment, the name of the student, the dates of the laboratory periods covered, the names of the laboratory partners, and the date that the laboratory report is due.

b. Objectives

Statement of the point of the experiment - in no more than two sentences.

c. Procedures

DO NOT recapitulate the laboratory protocol. Write in you OWN words. A clear flowchart of the procedures is recommended.

d. Results

This section should summarize your observations presented in the form of graphs, calculations, tables, etc.

e. Discussion

Evaluate your data. Explain what you observed and also why you think the data were as observed. Do not restate procedures! List possible sites of error. Whenever possible demonstrate your understanding of the theory behind the experiment. Support your results (e.g.: “Using the linear portion of the Absorbance vs. Concentration graph to calculate the slope, it was determined that...”) (Limited to only one page per experiment for experiments 1 - 6 and four pages for experiment 7-9).

3.If any laboratory report is not completed and turned in by the end of the quarter, the student maybe receive an Incomplete for the course at the discretion of the instructors; alternatively a “zero” for the missing laboratory report will be recorded and the final grade determined accordingly.

质粒DNA的提取酶切与PCR鉴定20xx医学第二实验室

【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):

第一部分

实验一:聚合酶链式反应

1、实验原理:在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外复制DNA的过程。

2、实验材料:实验仪器:PCR仪(BioRad MJ mini)、台式离心机、微量加样枪、灭菌薄 壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统

实验药品:1. 菌液:大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)

2. 引物:正向: 5’ GGC ATA TGG TGA GCA AGG GCG A 3’ 反向: 5’ CGG GAT CCC TTG TAC AGC TCG TC3’

3. 2〓Premix Taq:Taq酶:5U/μl、 4〓dNTP: 各10mmol/L、 10〓缓冲液(buffer): 500mmol/L KCl,100mmol/L Tris-HCl XX】

4. 灭菌去离子水

3、实验步骤:?取0.2 ml PCR反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂 (注意每换一种试剂换一个新吸头)

?

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?加好试剂后将反应管放入仪器中。实验过程约1小时30分钟。

4、注意事项:如配好的反应液较多沾到管壁上,可将PCR反应管臵台式离心机中瞬时离心,使反应液集中于管底,然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 .

实验二 :质粒DNA提取与定量

1、实验原理:?硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,不吸附蛋白质、多糖等物质;

?通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;

?低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱

2、实验材料:(一)仪器:恒温培养箱、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅

(二)材料:含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α?

(三)试剂: LB培养基(液体、固体)

AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒(爱思进,中国)

溶液 P1(S1)、溶液 P2 (S2)、溶液 P3(S3)、去蛋白液 PE

(W1)、漂洗液 WB(W2)、洗脱液 EB(Eluent)

3、实验步骤:

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4、注意事项:?不要使用过多菌体。重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质 ? 加入RNaseA室温放臵一段时间。溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊,臵于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。

?加入溶液II 和III后防止剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16

小时。

④ 加溶液I后,必须要将菌体悬浮彻底,不得有块状或大颗粒状呈现,是质 粒DNA提取的首要关键。

实验三:定量检测(紫外光吸收法)

1、实验原理:?物质在光的照射下会产生对光的吸收效应。

?而且物质对光的吸收是具有选择性的。

?各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。

2、实验材料:实验器材:eppendorf公司生产的紫外分光光度计、比色杯

实验药品:上一步获取的质粒DNA

3、实验步骤:

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4、注意事项:?注意拿比色皿的粗糙面。比色皿的光学窗口必须与光束方向一致。 ?注意比色皿中不要有气泡或悬浮物。

?比色皿较贵,轻拿轻放,小心使用。

第二部分 酶切鉴定

1、实验原理:限制性内切酶(restriction endonuclease)是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的

特异位点上,并在此切割双链DNA。

2、实验材料:实验器材:恒温水浴箱、微量加样枪、1.5mlEP管

实验药品:(1)菌液:大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因GFP片段的pMD19-T)

(2)无菌水、质粒DNA 、Hind III (15U/ul)、EcoR I (12U/ul)

(3)10〓R+BSA酶切缓冲液

3、实验步骤:

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4、注意事项:反应前可将EP管低速离心,可使混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 第三部分 琼脂糖凝胶电泳

1、实验原理:?琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

?DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。 ?DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速

度与分子量的对数值成反比关系)。

2、实验材料: 琼脂糖、Gelview (核酸染料)、TBE、6〓loading Buffer(加样缓冲液):含电泳指示剂、比重物质、缓冲液,DNA Marker 5000。

3、实验步骤:

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4、注意事项:?电泳前,确认样品孔位于电场负极。

?点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡,缓冲液不要太多。

?Geldview有毒,切勿用手接触,更不要污染环境,胶勿乱扔,紫外线照射不要太久。

【实验报告第二部分(实验记录):①主要实验条件(如材料的来源、质量;试剂的规格、用量、浓度;实验时间、操作要点中的技巧、失误等,以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据);②实验中观察到的现象(如加入试剂后溶液颜色的变化);③原始实验数据。评分(满分20分):

第一部分

实验一:聚合酶链式反应

1、主要实验条件:?老师提供的实验材料,仔细小心加入。

?按顺序加入试剂,如配好的反应液较多沾到管壁上,可将PCR反应管臵台式离心机中瞬时离心,使反应液集中于管底,然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 。

2、实验中观察到的现象:无明显现象。

3、原始实验数据:实验进行大概需要1小时30分钟。

实验二:质粒DNA提取与定量

1、主要实验条件:?基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异;高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA变性。

?溶液 S1/P1 :50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris〃Cl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA (pH8.0)、Rnase

?溶液 S2/P2:0.2 mol/ L NaOH、1% SDS

④溶液 S3/P3 :5mol/L 乙酸钠 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml

2、实验现象:?加入250μl 溶液S2,颠倒4~6次混匀(不要剧烈振荡),溶液变得清亮。

?得到的质粒DNA无色透明

3、原始实验数据:见实验三 XX】

实验三:定量检测(紫外光吸收法)

1、主要实验条件:eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值。

2、实验现象:无明显现象。

3、原始实验数据:

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第二部分 酶切鉴定

1、主要实验条件:?双酶切限制酶的选择非常重要,尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER ;如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话,就可以用这种buffer作为反应buffer;如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份,相似的话可以考虑各取一半中和。

? 酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积,而且最大反应体系最好不要小于20 ul。

2、实验中观察到的现象:无明显现象。

3、原始实验数据记录:见第三部分。

第三部分 琼脂糖凝胶电泳

1、主要实验条件:?溴化乙锭(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐),可与DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性。

?Gelview: 是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物,能产生极强的荧光信号,其灵敏度比EB高, 且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光

照射下呈现绿色荧光。

?电泳指示剂:(1)溴酚蓝,电泳中呈现蓝色条带,位臵大约相当于300bp的DNA;(2)二甲苯青,电泳中呈现绿色条带,它携带的电荷量比溴酚蓝少,相当于4000bp左右大小DNA的位臵。

④DNA Marker :是分子量不同的DNA片段,主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时,加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。

2、实验中观察到的现象:在电泳槽中,可以看见电泳指示剂移动,相同物质的涌动速率大致一样。

3、原始实验数据:见实验报告第三部分。

【实验报告第三部分(结果与讨论):①结果(定量实验包括计算):应把所得的实验结果(如观察现象)和数据进行整理、归纳、分析、对比,尽量用图表的形式概括实验的结果;②讨论:不应是实验结果的重述,而是以结果为基础的逻辑推论。③结论:简单扼要,说明本次实验所获得的结果。(包括思考题)。评分(满分45分):

第一部分

实验一:聚合酶链式反应

实验二:质粒DNA提取与定量

实验三:定量检测(紫外光吸收法)

1、结果:

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2、讨论:经查阅资料 Ratio= 1.8 DNA样品较纯,符合实验要求

Ratio>1.9 RNA污染

Ratio<1.6 有蛋白质或其它杂质的污染

?本次实验Ratio值(A260/A280)为1.817,基本符合要求,但仍有少量RNA。 ?计算确定DNA浓度,公式如下:

质粒DNA(?g /ml)=50〓(OD260) 〓 稀释倍数 ( 2微升稀释至100微升 ) ?我们用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值。经试验质粒DNA浓度为 317.3μg/ml ④ 定量检测时有多个样品,每次测定下一个样品时需仔细冲洗,以免测定的浓度有影响。 XX】

⑤酚具有腐蚀性,能损伤皮肤和衣物,使用时应小心。皮肤如不小心沾到 酚,应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

3、结论:关于质粒DNA的定量测定实验,提取的质粒DNA Ratio值(A260/A280)=1.817,没有较大污染,符合实验要求。质粒DNA提取与定量成功为下面的琼脂糖凝胶电泳奠定了基础。实验中还应更注意细节问题,基本的操作要求,逻辑要清楚,争取不要有失误。

第二部分 酶切鉴定

第三部分 琼脂糖凝胶电泳

1、结果:

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2、讨论:?7、8、9号泳道为本组实验现象。

?分析2、5、8号为酶切片段;3、6、9号为质粒DNA;4、7、11号为PCR目的片段。

?质粒DNA为完整态;酶切片段有长片段,接近2700bp,还含有目的基因的短片段率小于500bp;PCR目的片段扩增约为500bp。

④有的酶切片段并不清楚,原因:Marker条带很清楚,说明凝胶没问题;可能

是所用质粒的量太少;也有可能是酶切过程相关试剂被污染。

⑤片上出现预期以外的酶切片段,可能是酶切不完整,质粒未被完全切开,出现其他构型的质粒。

3、结果:酶切产物、PCR扩增片段、质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分离、染色后,观察到4条区带。与Marker相比,酶切片段电泳迁移率大的一条区带率小于500bp;电泳迁移率小的区带在2500~3000bp,符合预期试验结果。

思考题

1、碱法提质粒中溶液I、II、III的作用?

答:溶液 S1/P1 作用是葡萄糖悬浮细胞,EDTA鳌合金属离子使DNase失活;溶液 S2/P2作用是细胞壁肽聚糖在碱性下水解,核酸和蛋白质变性;溶液 S3/P3 作用是酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀,Na+可中和DNA。

2、结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率?

答:(1)提高DNA的浓度,尽量将其中的蛋白质除尽;(2)因为不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同,可以先用要求低盐缓冲液的限制性内切酶消化DNA,然后补足适量的NaCl,再用要求高盐缓冲液的限制酶消化;(3)要有适宜的温度,一般在37度左右;(4)DNA分子构型对核酸内切限制酶的活性有很大影响,如消化超螺旋的DNA比消化线性DNA用酶量要高出许多倍,可以改变DNA的构象,使其简单化。



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