实验四 质粒DNA的提取(4200字)

发表于:2017.6.11来自:www.ttfanwen.com字数:4200 手机看范文

实验四 质粒DNA的提取、电泳检测和酶切

一、实验目的

学会用碱裂解法小量制备质粒DNA。

二、实验原理

质粒DNA是存在于细菌中的环状小分子DNA,不同于长链大分子的基因组DNA,游离于细胞质中。由于细胞中的RNA可以被降解,大分子DNA可与细胞碎片一起沉淀而与质粒DNA分离。质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等,其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。 其原理为:在碱性溶液中,双链DNA氢键断裂,DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性,但由于质粒DNA分子量相对较小,且呈环状超螺旋结构,即使在高碱性pH条件下,两条互补链也不会充分分离,当加入中和缓冲液调时,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离,难以复性而形成缠绕的结构,与蛋白质—SDS复合物结合在一起;当K+取代Na+时,生成不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。

通过离心沉淀,细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质可被除去,而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。再用酚/氯仿处理,可去除残留蛋白质。

三、实验材料

含有质粒pUC19的大肠杆菌菌株DH5a。

实验四质粒DNA的提取

四、实验器具、药品试剂

A、实验材料:

? DH5a受体菌

? pUC19

B、实验仪器

? 高压灭菌锅

? 超净工作台

? 恒温摇床取

? 台式离心机(冷冻或非冷冻式)

? 旋涡振荡器

? 电泳仪

? 凝胶成像系统

? 培养用试管

? 量筒

? 冰盒

? 微量取液器(2ul,20ul,150ul,1000ul)

? 吸管头若干(2ul,20ul,150ul,1000ul)

? EP管若干

? 一次性手套若干

C、溶液药品:

? LB培养基

? 氨苄青霉素(Amp,100 mg/ml)

? 20%SDS

? 4 M NaOH

? 3M NaAc (pH5.2)

? 异丙醇

? TE缓冲液(pH8.0)

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

?

溶液I-GET缓冲液:

50 mmol/L葡萄糖,

10 mmol/L EDTA,

25 mMTris-HCl pH8.0。

溶液II(现配现用)-0.2 mol/L NaOH,

1%SDS

溶液III (4℃预冷)-乙酸钾溶液(3M,5M? pH=4.8):

60 mL的5 mol/L KAc,

11.5 ml冰醋酸,

28.5 mL H2O

TE缓冲液或双蒸水(+ 20 ?g/ml RNase ):

10 mmol/L,Tris-HCl,

1 mmol/L,EDTA , pH8.0,

五、实验方法

(一)质粒DNA的提取

1 在超净工作台上将2份5 ml含有50 ug /mL Amp的LB培养液加入已灭菌的试管中,

2 挑取数个单菌落(含有50ug/ml氨苄的LB平板,含pUC19质粒)的DH5a菌液,接入上述5 mL含有氨苄青霉素(50 ?g/ml)培养基中,37℃摇床150rpm培养5小时,培养基明显浑浊。

3 取1.5 ml菌液于1.5 ml离心管中,12000 r/min离心2 min,去上清液。

4 在沉淀中加入150 ?l溶液I,盖上盖后在漩涡振荡器上混匀,充分悬浮菌体,置冰上5 min。

5 加入300 ?l新配制的溶液II(变性液),加盖颠倒6-7次使之混匀;不要强烈混匀。置冰上5 min。

6 加入225 ?l溶液III,加盖后颠倒6-7次,加盖颠倒6-7次使之温和混匀,置冰上15 min。 RNAase A(10 mg/ml) 70%乙醇 无水乙醇 75%乙醇, NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder), EcoR I 及Dra I(Dra II?)限制性核酸内切酶(TaKaRa), EcoRI酶解缓冲液(10×H buffer) 10%琼脂糖 电泳缓冲液 EB染色液

7 12000 r/min离心5 min,上清移入另一干净离心管,加入等体积的氯仿/异戊醇(12:1),反复倒置2 min,充分混匀;

8 12000 r/min离心10 min,上清移入另一干净离心管,并加60%体积的异丙醇混匀,12000 r/min离心10 min,弃去上清液(注意沉淀的位置);

9 沉淀加1 ml 70-75%乙醇,倒置1-2次,10000 r/min离心5 min,弃去上清液,可见黄色沉淀块。重复上述洗盐过程一次。小管倒置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干燥(10-15分钟),至管壁内无水珠;

10 其中一份加入20 ?l含有20 ?g/ml RNase(无DNAse)的TE 缓冲液溶解提取物,另一份加入20 ?l TE 缓冲液溶解提取物,反复弹离心管100次,1000rpm离心20秒。(RNase处理方法:Takara,10mg/ml,先将RNase用其自身稀释液稀释50倍至200ug/ml,去2ul加入20ulTE,其终浓度为20ug/ml。)

11 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。

(二)质粒DNA质量检测

琼脂糖凝胶电泳检测,原理和方法见实验一和实验三。

电泳结果:RNase处理的结果中没有RNA,pUC19质粒两条带清晰,大小正常。没有RNase处理的结果中有大量RNA,pUC19质粒两条带存在,大小正常。

实验四质粒DNA的提取

←2000bp

←1000bp

←750bp

←500bp

超螺旋快于线性,线性快于开环。(碱法提的质粒三条带中有螺旋,开环另外一条不是线性的DNA,在提

取中线性DNA容易被降解,所以两条带。

(三)质粒DNA的酶切

酶切体系25 μl,做4组:

第一组

质粒来源

10 × 酶切缓冲液

(M)

质粒DNA

EcoRI

Dra I

无菌双蒸水 1号管质粒 2.5 μl 第二组 1号管质粒 2.5 μl 第三组 2号管质粒 2.5 μl 第四组 2号管质粒 2.5 μl 7.5μl (0.5~1.0 7.5μl 7.5μl (0.5~1.0 7.5μl(0.5~1.0 μg) (0.5~1.0 μg) μg) μg) 1 μl 1 μl 13 μl 不加 不加 13 μl 1 μl 1 μl 13 μl 不加 不加 13 μl

酶切缓冲体系EcoRI为H,但是在M体系活性为100%;酶切缓冲体系Dra I为M,两种酶均为Takara酶。因

此,使用M缓冲体系。

混匀酶切反应物后,于37℃下酶切2 h。

实验四质粒DNA的提取

←2000bp 1176bp→

799 bp→

692 bp→ ←1000bp ←750bp

←500bp

六、注意事项

用移液器操作时,每一步都要格外小心,特别是在加入溶液II 和III后,一定不要剧烈振荡,以免细菌基因组DNA污染!

七、思考题

(1)质粒的基本性质有哪些?

(2)在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题?

附录:

pUC18 和 pUC19质粒图谱

pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ,是最常用的质粒载体,其结构组成紧凑,几乎不含多余的 DNA 片段,GenBank注册号为 L08752(pUC18)和 X02514(pUC19)。由 pBR322 改造而来,其中 lacZ (MSC)来自 M13mp18/19 图 3-4 是其质粒图谱。

这两个质粒的结构几乎是完全一样的,只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因,因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列,在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后,可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

实验四质粒DNA的提取

特征序列区位:

pBR322_origin 1471 - 852

Ampicillin 2486 - 1626

lac_promoter 543 - 514

AmpR_promoter 2556 - 2528

M13_pUC_rev_primer 500 - 478

M13_reverse_primer 479 - 461

M13_forward20_primer 379 - 395

M13_pUC_fwd_primer 364 - 386

lacZ_a 398 - 250

pGEX_3_primer 51 - 29

Orf2 2486 - 1626

NOS terminator sequence:

ggatccatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttgtttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacacgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagtaatcgat

设计引物:

Forward primer: 5’ ggaGGATCCggatccatcgttcaaac 3’ (含BamH I 位点GGATCC及三个保护碱基) Reverse primer: 5’ atcGAATTCATCGATTACTAGTAACATAG 3’ (含EcoR I 位点GAATTC及三个保护碱基)

请查一下NOS终止子序列内有没有这两个酶切点。如果没有,引物合成后,以任何一种pCAMBIA为模板都能扩增到该终止子序列。

DraI在pUC19上有3个切点,分别位于1563,1582,2274,所切片段为:19,692,1975bp。 EcoR I pUC19上有1个切点,位于396,所切片段为:2686bp。

双酶切后,切点位于:396,1563,1582,2274。所获片段4个,大小分别为: 19,692,799,1176bp




第二篇:质粒DNA的提取与纯化实验教案 100字

1、质粒DNA的提取与纯化实验教案

质粒DNA的提取与纯化实验教案

2、质粒DNA的酶切与电泳检测实验教案

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3、植物基因组DNA的提取和纯度鉴定实验教案

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4、聚合酶链式反应(PCR)基因扩增实验教案

质粒DNA的提取与纯化实验教案

5、DNA体外重组实验教案

质粒DNA的提取与纯化实验教案

6、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验教案

质粒DNA的提取与纯化实验教案

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